成果简介：
感受态细胞是一种生物试剂，生物试剂应用场景广阔，从高校科研、企业研发到企业扩大生产，几乎伴随生物科技和生物医药产业全流程。分子克隆实验是生命科学领域常规实验，因此感受态细胞作为分子克隆技术的基石，在高校实验室、生物科研院所、医院及一些涉及分子克隆实验的公司及研究机构中受到广泛的应用。将目的DNA片段转化进入宿主菌是进行DNA克隆的关键步骤，目前常用的两种方法为化学转化和电转化。因为电转化方法组装的DNA在含有离子的含酶混合物里会使电穿孔效率明显降低，必须在电穿孔前进行DNA的纯化，但纯化过程中的DNA损失可能会导致克隆效率低下，因此它不常用于体外DNA克隆。所以，化学方法制备的感受态细胞是通常用于体外DNA克隆方法的最好选择。但目前在常用的克隆菌株中，能够广泛适用多种感受态制备方法的高效价大肠杆菌克隆菌株及其应用还未见报道。
本研究创新性的改造了菌株与制备工艺，提供了一株适用多种感受态制备方法的高效价大肠杆菌克隆菌株及其应用，以及一种适于制备高效价感受态细胞的缓冲液及其应用，有效解决了不同大肠杆菌制备感受态细胞其效价差异明显的问题。该菌株命名为BW3KD，适合于各种感受态制备方法，其效价在其他大肠杆菌中都处于较高位置，有效解决了不同大肠杆菌制备感受态细胞其效价差异明显的问题；且该菌株生长速度快，转化当天7h就可以长出单克隆，大大节省了克隆时间。该缓冲液命名为TSS-HI缓冲液，实验证实，应用本发明的缓冲液可以使普通大肠杆菌感受态效价由10⁷CFU/μg DNA提高到10⁸CFU/μgDNA，且该缓冲液和相应方法适用于多种大肠杆菌，也无需低温长时间培养，大大节省了感受态制备时间。而基于优化的TSS-HI法与BW3KD菌株结合的感受态效价可以稳定达到7.21×10⁹±1.85×10⁹CFU/μg DNA。
核心技术：
本研究所研发的高效价大肠杆菌克隆菌株BW3KD，是以大肠杆菌野生株BW25113为出发菌株，通过敲除其基因型中的基因endA、FhuA和DeoR制得。菌株BW3KD中基因endA的敲除可以提高质粒的质量，防止被核酸酶降解；fhuA的敲除可以使BW3KD免受T5、T1、φ80和UC-135-37噬菌体的侵染；deoR的去除可以提高菌株对大质粒的吸收。
本研究所述的适于制备高效价感受态细胞的缓冲液，其特征在于：所述缓冲液命名为TSS-HI缓冲液，配方是：聚乙二醇8000 60g/L-140g/L、二甲基亚砜50±5mL/L、甘油80mL/L-120mL/L、氯化镁1.9g/L-4.76g/L、用胰化蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L配制的LB液体培养基补齐到1L并用盐酸调pH至6.1±0.1，121℃高压灭菌后加入无菌4M的氯化锰25.6mL/L-52.6mL/L。且经过实验验证，多次用TSS-HI缓冲液进行感受态制备和效价测试发现，TSS-HI法效价比较稳定，不受实验条件和批次的影响，其效价基本可维持在7.21×10⁹±1.85×10⁹CFU/μgDNA。
优势1：应用本研究的适于制备高效价感受态细胞的缓冲液制备感受态细胞时，对配制所需试剂、培养基及细菌状态等条件要求比较宽容，也无需低温长时间培养，在提高感受态效价的同时大大节省了感受态制备时间，且该缓冲液和相应方法适用于多种大肠杆菌。
优势2：基于新优化的TSS-HI法与BW3KD菌株结合其感受态效价可以稳定达到7.21×10⁹±1.85×10⁹CFU/μg DNA，有效解决了不同大肠杆菌制备感受态细胞其效价差异明显的问题；且实验证实本研究所述菌株BW3KD适合于各种感受态制备方法，其效价在其他大肠杆菌中都处于较高位置。
优势3：基于菌株的高效价，可以提高DNA片段的组装效率、同时完成多个片段的组装、提高大质粒的转化效率，能够适配插入大片段基因序列并保持其较高的转化效率（一般的菌株插入的基因片段越大，其转化效率会显著减低），应用效果和应用领域均可得到提升。
优势4：菌株BW3KD具有生长快的优势，转化当天7h就可以长出单克隆，获得高效价扩增菌，大大节省了克隆时间。
优势5：与国外产品对比：同效价下,平均一次实验（1 reaction）花费247.3元（Thermo Fisher），本项目花费较低;与国内产品对比：国产菌株，平均一次实验（1 reaction）均价在2-10元不等，但其效价较低，效价测试通常低于5*10⁷CFU/μgDNA。
专利情况：已申请两项国家发明专利（申请号：CN202110794350.X，CN113502248A）。
市场前景：
随着全球对于生命科学领域的持续重视和投入，以及下游生物医药工业产业的蓬勃发展，生物试剂市场规模快速增长。2020年全球生物试剂市场约为188亿美元，中国生物试剂市场约为159亿元,2015-2020的复合年均增长率为17.2%,预计中国生物试剂市场未来将继续保持快速增长，2024年有望达到260亿元。我国生物试剂市场中分子类占比50%，蛋白类占比30%，细胞类占比20%,由科研用户主导（72%），其余为工业用户（28%）。预计2024年生物试剂市场分子类可达130亿元，蛋白类可达78亿元，细胞类可达52亿元。
TSS-HI法制备的BW3KD感受态细胞是实验室水平下的最高效价，可达(7.21±1.85)×10⁹ CFU/μg DNA。对比国内常见的的感受态细胞，花费相当甚至更低的价格，获得的产品效价更高，实验、科研的成功率更大；而对比国际一流企业的感受态细胞，在相近甚至更高效价水平上只须花费很少的费用。所以此产品一旦上市，并开始在研发和生产中发挥作用，有望在感受态细胞市场中占据一席之地。
